A PCR DIGITAL

A problemática Brettanomyces em enologia continua há vários anos no centro das investigações e das preocupações dos produtores.

A ênfase dada aos fenómenos de poliploides, às diferenças fenotípicas intraespecíficas que eles criariam, como nomeadamente a resistência ao SO2 ou a capacidade de aderir sobre os materiais da cave foram vias de melhoria inegáveis.

No entanto, em paralelo, a vulnerabilidade dos vinhos tende também a progredir: com o aumento do pH, os teores em açucares residuais, os teores em percursores das uvas cada vez mais “maduras”, o abaixamento dos níveis de SO2, a limitação das colagens são igualmente fatores que tornam os vinhos mais sensíveis às contaminações. As necessidades de desenvolvimentos analíticos que permitam um bom acompanhamento das populações são, portanto, necessárias.

Uma nova ferramenta integrou a bateria de análises das Brettanomyces disponível no Laboratório. Trata-se da PCR digital.

A PCR digital oferece uma sensibilidade que permite melhor antecipar os fenómenos de desenvolvimento nos vinhos, mas igualmente de considerar estratégias mais preventivas avaliando corretamente as evoluções das populações sobre as uvas no aproximar das vindimas, por exemplo.

Os métodos de PCR progrediram nitidamente após as primeiras utilizações em análise qualitativa que permitia, por exemplo, confirmar a presença de Brettanomyces sem, no entanto, conhecer a concentração exata e, portanto, com o risco inerente.

A PCR quantitativa (ou PCR “em tempo real”) desenvolveu-se. A multiplicação do ADN alvo é acompanhada por fluorescência (cada filamento neo-sintetizado acompanhado de um aumento da fluorescência seguida em tempo real é assim correlacionada com a quantidade de ADN e, portanto, de células inicialmente pressentes na amostra). O número de multiplicações necessárias para atingir uma fluorescência limite, corresponde, portanto, a uma concentração em células na amostra. Este método permite quantificar numerosos microrganismos entre os quais as Brettanomyces nos vinhos e evidenciar assim as populações para avaliar os riscos. Objetivar especificamente a população de Brettanomyces em tempo real foi um avanço importante na prevenção da contaminação.

O complemento de uma caracterização das curvas de fusão dos filamentos de ADN neo-sintetizados aquando da reação de polimerização da PCR permitiu adicionar a identificação de certos grupos de estirpes especificas à quantificação da população total. Esta técnica é denominada TYP\Brett. Esta fornece a população total de Brettanomyces e igualmente a percentagem de estirpes triploides resistentes ao SO2 e a percentagem de estirpes triploides propicias aos fenómenos de adesão.

Atualmente, a TYP\Brett é a única análise que reúne a precisão da análise genética e a caracterização de traços fisiológicos particularmente uteis aos técnicos. Em caso de níveis de população elevada de Brettanomyces, a ação enológica será diferente conforme as estirpes são ou não resistentes ao SO2.

Muito proveitosa, a PCR apresenta três fragilidades relativas, por ordem de importância: o risco de deteção de ADN de células mortas, a amplificação do ADN que pode ser perturbada pelos taninos e pelo facto do seguimento do aparecimento de uma fluorescência em tempo real necessitar de um equipamento rigoroso.

Para ultrapassar estas limitações, o recurso a uma nova metodologia, a PCR digital, pareceu pertinente.

Assim, não se trata de 1, mas perto de 30 000 PCR ponto final, que são realizados por amostra.

COMO FUNCIONA A DPCR?

A preparação de uma D-PCR é semelhante à de um Q-PCR, mas, antes de iniciar os ciclos de multiplicação, as amostras são dispersadas em 30 000 reações.

A utilização de cálculos estatísticos permite dispensar a utilização de gamas de calibração e limitar assim as necessidades para cada análise.

Enquanto que a Q-PCR permitia a deteção a partir de 10 células por mililitro, a D-PCR permite a deteção de uma célula em 10 mililitros de amostra. A sensibilidade é, portanto, 100 vezes mais elevada aquando de uma D-PCR.

AS CÓPIAS DE ADN

Assim, os resultados de uma D-PCR são indicados em cópias de ADN, mas igualmente com um equivalente em células por mililitro para facilitar a interpretação e o acompanhamento induzido por estas análises.

NOVAS PISTAS DE VIGILÂNCIA NOS ITINERÁRIOS ENOLÓGICOS

 A sensibilidade da D-PCR é uma vantagem inegável para conduzir as ações enológicas:

– Acompanhamento das populações sobre as uvas na vinha: a utilização da D-PCR permitiu evidenciar baixas populações de Brettanomyces sobre as uvas que não seriam detetadas pela simples Q-PCR.                                                                                                                                                             Acompanhamentos das fermentações e dos vinhos resultantes, permitindo assim confrontar estes inventários com o risco de desvios de fenóis voláteis.- Finalmente, melhorando o nível de deteção, a D-PCR impõe-se como a análise de seleção para o controlo de acompanhamento dos engarrafamentos.